萃取DNA步驟
1. 戴手套、準備剪刀、rank(離心管架)，從滅菌過的鐵盒中倒出所需數量的大eppendof到紙巾上並蓋上，在蓋子上寫上樣本編號。
剪刀不確定是否乾淨可再用清水洗過並裝在燒杯，再準備一個燒杯放用過的剪刀。eppendof倒多的不可放回鐵盒，可重新放入補充包再滅菌。
2. 剪肉放入eppendof，泡95%酒精，10min以上。
通常是從酒精標本上取組織。
3. 預熱Shaker、incubator。
4. 剪1mm2的組織放入eppendof，放65℃ 10分鐘，把酒精蒸乾。
1. 約1mm2就好，太少萃不到東西太多雜質過多，可以是剪碎狀。
2. 之後的proteinase k怕酒精。
5. 注入300µl lysis buffer後，放65℃ 10分鐘，邊加熱邊剪碎肉。
1. 用1000µl pipetman +大tip
2. 12管剪完就算加熱好了，用完不用關機等一下還會用到。
3. lysis buffer裡面有EDTA、SDS等，EDTA阻斷陽離子，抑制DNA酶作用。SDS溶解細胞膜，及讓蛋白質變性。
4. 剪碎有助於proteinase k更快消化組織。
6. 注入2µl proteinase k，插上eppendof夾子放入shaker搖1小時以上。
夾子在抽屜。
proteinase k用完放冰箱。
proteinase k可以把雜蛋白質切掉，且使核酸酶失去活性。
─────────────午餐時間───────────────
7. 開離心機暖機。準備同樣數量的新eppendof並寫上編號。注入100µl 2號buffer後震離，斜放在冰枕三分鐘，再離心三分鐘後，取上清液注入新的eppendof。
buffer都放在桌上的紙盒子裡。
設定13000轉3分鐘，等到10000轉沒異音才離開。試管關節朝外。
2號buffer可以使雜質沉澱。
8. 注入300µl異丙醇，離心三分鐘後，吸乾上清液。
異丙醇放在上方玻璃櫃中。
醇類具有脫水性，可以將DNA的水分脫掉後沉澱。Isopropanol使DNA沉澱的效果比較好，但無法分開大多數鹽類。
9. 注入300µl酒精，離心二分鐘後，吸乾上清液後，再65度10分鐘以上。
Ethanol有清洗的作用，可以把剛剛沉澱中的多數鹽類給去除。
10. 注入35µl 3號buffer，vortex後小烏龜離一下，再冰到冰箱。
可放冰箱冷藏，如果隔數日可放-20度冰箱。組織放同一個盒子，DNA放同一個盒子。
回溶DNA。
PCR步驟
1. 先開PCR機暖機，設定時間、溫度、次數。
2. 準備相同數量的小eppendof
3. 稍微震離DNA、2種primer
震太久會傷害DNA
4. 加入ddH2O→二種primer→DNA→premix buffer
用20 µl pipetman
先從無反應的溶劑先加，加完6管再換tip。第一種primer沒碰到管壁可加六管，第二種primer、DNA每次都換tip。
5. 震離eppendof
6. 試管放入PCR機，設定25mL，等待約2.5 hr
eppendof先放入塑膠孔盤再放入避免融化。
試管要放好到同一高度才能關上。
1 µl DNA
1 µl R-primer
1 µl L-primer
9.5 µl ddH2O
12.5 µl premix buffer (包含taq、dNTP、MgCl2及其他成分)
Preheat: 95，5:00
Denature: 95，0:30
Annealing: 45，0:30 35 cycles
Extension: 72，0:40
Additional: 72，5:00
DNA電泳製膠
7. 準備一個燒杯倒入約1 g Algae粉
8. 量筒裝100 ml的buffer倒入燒杯
9. 燒杯蓋上保鮮膜，微波45秒後用布手套取出，放入攪拌子放到加熱攪拌機上，約5分鐘。
微波可加快Algae粉末的溶解速度。
10. 加熱中加入5µl 紫外光顯影染劑。
11. Algae溶液一次可做小盤的一大二小的膠。
慢慢倒膠，大小格倒均勻，敲邊緣排除氣泡，插上齒梳推到底，小格的齒梳中間有空缺。
─────────────午餐時間───────────────
12. 打開電泳槽設定30 min+100 v
13. 拔齒梳，放入電泳槽
14. 打開monitor暖機
15. load 5µl PCR過的DNA，6個或3個中間留一格load染劑
16. 膠放入紫外光機，調整焦距，列印二張照片
一張自己留著一張給基隆米克斯
17. 用parafilm封住eppendof，放入夾鏈袋寫上CO1
18. 約二圈，不能破
19. 寫定序單，將照片、定序單對折、夾鏈袋，放入10號夾鏈袋，放入牛皮信封內再夾上已印好的連絡地址紙，釘書機釘住信封口，貼上黑貓包裹貼紙
資料來源:
特生中心指導
